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血清胱抑素C測定的臨床意義及方法學進展
日期：2011-08-08 00:00:00
摘要 在腎小球濾過功能試驗中，血清肌酐、尿素及內生肌酐清除率是最常用的指標。由于以上指標尚存諸多不足，故人們一直在尋找新的反映腎小球濾過率變化的指標。胱抑素C是一種低分子量蛋白質，是半胱氨酸蛋白酶抑制物超家族的成員之一，可由機體所有有核細胞產生，產生率恒定。循環中的胱抑素C僅經腎小球濾過而被清除，是一種反映腎小球濾過率變化的理想的內源性標志物。血清胱抑素C濃度在作為腎功能試驗時優于血清肌酐濃度。至于胱抑素C測定的方法學，已有快速、簡便且可自動化的“顆粒加強免疫比濁法”的最新報道，使血清胱抑素C測定的廣泛臨床應用成為可能。
關鍵詞：胱抑素C；腎功能試驗；GFR；肌酐
胱抑素C（Cystatin c）是一種低分子量蛋白質，Grubb等首先報道其血清濃度與GFR密切相關，可作為腎小球濾過功能指標[1]。近年來有關胱抑素C測定的臨床應用及方法報道日漸增多，本文就胱抑素C的結構與功能，作為反映腎小球濾過功能的內源性標志物及方法學進展作一綜述。
1 胱抑素C的結構與功能
胱抑素C，以前也被稱為γ-微量蛋白及γ-后球蛋白，是一種低分子量、堿性非糖化蛋白質，分子量為13KDa,由120個氨基酸殘基組成，是一種分泌性蛋白質。細胞先合成一個帶信號肽的前體蛋白，編碼胱抑素C的基因位于人類第20號染色體，大約為4.3Kb，包含3個外顯子，基因上游45-50核苷酸處為“TATA盒樣”序列（ATAAAA）。胱抑素C基因5′-側翼區GC含量較高，轉錄起始位點上游400bp序列的G+C＞70%，富含GC的“島”也包括外顯子1及內含子1、5′側的一部分，整個富含GC“島”約900bp，G+C含量為73%。此區域CpG/GpC比值接近于1，因此此區CpG是非甲基化的。在胱抑素C基因5′側翼1Kb序列中發現了2個“GC盒”（GGGCGG），此區也發現了增強子核心樣序列（GTGGAAGG）。由以上可見，胱抑素C基因5′側翼序列與“看家基因”的啟動子區具有相同的特性，即缺乏典型的“CAAT盒”、富含GC、有與轉錄因子Spl結合的“GC盒”。故可將胱抑素C基因看作是“看家基因”（house-keeping gene），即此基因在所有組織恒定持續地轉錄及表達。Northernx印跡也發現胱抑素C基因在所有的被觀察的組織均表達，包括腎、肝、胰、腸、胃、肺及胎盤[2]。
由于胱抑素C是一種分泌性蛋白質，故廣泛地存在于各種體液中，如腦脊液、血液、唾液、精漿等。至于胱抑素C的確切生物學功能目前還了解不多，研究發現胱抑素C是半胱氨酸蛋白酶抑制物超家族的成員之一，是目前發現的對組織蛋白酶B抑制作用最強的抑制物，對木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶、組織蛋白酶H及L也有抑制作用，故胱抑素C的一個生理學功能可能是調節半胱氨酸蛋白酶的活性。胱抑素C基因突變可導致遺傳性胱抑素C淀粉樣血管?。℉CCAA），可發生腦動脈血管破裂，這是目前發現的直接與胱抑素C相關的臨床疾病。
2 胱抑素C作為反映腎小球濾過功能的內源性標志物
由于胱抑素C基因屬“看家基因”，能在幾乎所有的有核細胞表達，無組織學特異性，故機體胱抑素C產生率相當恒定。因胱抑素C是一種低分子量蛋白質，可經腎小球自由濾過，在近曲小管被重吸收并降解，腎臟是清除循環中胱抑素C的唯一器官，所以血清胱抑素C濃度主要由GFR決定，由此可見胱抑素C是一種理想的反映GFR變化的內源性標志物。
grubb及Simonsen等[1]首先研究了血中低分子量蛋白質（β2-微球蛋白、視黃醇結合蛋白、胱抑素C）濃度與GFR（51Cr-EDTA清除率）的相關性，發現血清胱抑素C、β2-微球蛋白及視黃醇結合蛋白濃度的倒數與GFR的相關系數γ分別為0.75、0.70及0.39，血清肌酐濃度倒數與GFR的相關系數γ為0.73?？梢婋滓炙谻是低分子量蛋白質中與GFR最相關的內源性標志物，甚至優于血清肌酐。血清β2-微球蛋白濃度由于在炎癥、腫瘤及免疫疾病時也可升高，故不是理想的GFR內源性標志物，視黃醇結合蛋白的代謝十分復雜，且部分與前白蛋白結合，不能自由經腎小球濾過，故血清視黃醇結合蛋白濃度的倒數與GFR相關性最差，不能作為GFR的內源性標志物。胱抑素C即使在炎癥狀態下，其產生率也不會改變，血清濃度受年齡、性別、疾病的病情變化的影響較小。Pergande等用99mTc-DTPA清除率作為腎小球濾過功能的“金標準”（＜1.36ml/s為腎小球濾過功能受損，分析了胱抑素C、β2-微球蛋白及肌酐的血清濃度的診斷敏感性，結果發現它們診斷腎功能異常的敏感性分別為88.2%、64.7%及52.9%[3，4]。隨后Newman報道[5]血清胱抑素C、肌酐濃度診斷異常GFR的敏感性分別為78.1%及57.1%，各自濃度倒數與GFR（51Cr-EDTA清除率）的相關系數分別為：0.81、0.50。Kyhse andersen[6]及Filley[7]的最近臨床應用也表明血清胱抑素C濃度與GFR的相關性優于血清肌酐濃度。ROC（Receiver operating Characteristic）作圖分析發現，通過改變“分割限”（cutoff limit）使胱抑素C的診斷敏感性下降至70%時，其診斷特異性仍可達75%；而通過改變血清肌酐濃度的“分割限”，使其診斷敏感性下降至50%時，才能獲得100%的特異性，使敏感性增加至100%時，其特異性接近于零。各自ROC曲線下面積相差顯著（P＜0.001），說明胱抑素C的診斷準確性明顯優于血清肌酐。
表1 各種測定方法比較
|
方法 |
檢測限μg/L |
CV% |
測定時間 |
參考范圍x±SD（范圍），mg/L |
分析樣品數 |
|
RID |
300 |
11 |
38h |
1.3±0.26(0.72～1.7) |
46 |
|
EIA |
30 |
10 ～12 |
16h |
1.1±0.42(0.63～2.5) |
30 |
|
RIA |
1.3 |
n.d. |
16～21h |
0.96±0.20(0.6～1.7) |
100 |
|
FIA |
1 |
n.d. |
lor3h |
n.d. |
|
|
EIA |
|
n.d. |
4.5h |
1.1±0.15 |
20 |
|
EIA |
1.9 |
4～5 |
5h |
0.75±0.65(≤20歲) |
85 |
|
1.34±0.95(＞20歲) |
189 | ||||
|
0.195 |
4～8 |
1.5h |
1.25±0.22(0.86～1.7) |
50 | |
|
EIA |
0.9 |
3～9 |
2h |
1.78±0.26(女) |
33 |
|
2.14±0.31(男) |
33 | ||||
|
PETIAm |
150 |
2.0～3.2 |
7min |
(0.61±1.21) |
27 |
|
PETIA |
27 |
3～5 |
5min |
＜1.25 |
|
|
PENIA |
170 |
3～5 |
6min |
(0.64～1.04) |
30 |
3 血清胱抑素C測定的方法學
由于血清中胱抑素C濃度較低，故其測定方法需較高的分析靈敏度及特異性。Lofberg等首先用單向免疫擴散法（RID）及酶免疫測定法（EIA）對胱抑素C含量進行測定，按照目前的標準，當時報道的這兩種方法不僅費時，而且檢測限也差（分別為300，30μg/L）。隨后，又有較簡單且更靈敏的放射、熒光及各種酶免疫測定（RIA、FIA及EIA）的方法報道，以改善胱抑素C測定的可靠性。 1993年Pergande等[3]報道了一種夾心酶免疫測定方法，其檢測限雖然很低（0.9μg/L），但測定時間仍較長，無法常規應用，更無法用于急診測定。以上各種測定方法均屬非均相測定方法，很難自動化，因此限制了胱抑素C的廣泛臨床應用。膠乳免疫測定是一種均相測定方法，在膠乳顆粒上包被抗體，與抗原結合時顆粒發生凝集，此方法很容易自動化。Kabanda等于1994年報道的測定胱抑素C的膠乳顆粒凝集法是一種顆粒計數免疫測定法[8]。Kyhse andersen等[6]于同年報道了一種顆粒增強透射免疫比濁法（particle-enhanced turbidimetric immunoassay, PETIA），使胱抑素C測定的時間縮短至5min左右，且可在自動生化分析儀上進行，使胱抑素C測定的常規應用成為可能。隨后，Newman等也報道了類似方法[9]。1997年，Finney等報道了一種能快速自動測定胱抑素C的顆粒增強散射免疫比濁法（particle-enhanced nephelometric immunoassay, PENIA），其測定結果與PETIA法相關性良好[10]。各種胱抑素C測定方法的比較見表1。
從表1可見，單純就檢測靈敏度而言，RID法最差，而EIA、RIA及FIA法[11～14]均優于PETIA及PENIA法。由于RIA法存在放射性污染，FIA法需昂貴的儀器，以及RIA、FIA、EIA法測定時間長，且不能全自動化，無法用于臨床大批量標本的測定。PETIA及PENIA法雖然檢測靈敏度差些，但仍可達150μg/L左右，遠遠低于健康人血清胱抑素C濃度的下限值，可滿足臨床需要；這兩種測定方法基本上不受血紅蛋白、膽紅素、類風濕因子、甘油三酯的影響，回收率可達95%～109%，批內及批間變異系數均較?。ǎ?.5%）；加上這兩種方法可全自動化，故在血清胱抑素C測定的常規臨床應用中可首選PETIA或PENIA法。
各位研究者所報道的血清胱抑素C濃度的參考范圍有一定的差異，這一方面是由測定方法不同所致，另一方面與所用胱抑素C標準品的來源不同有關，現應用的胱抑素C標準品有3種類型：①從人尿中純化的胱抑素C；②純化的人類胱抑素C，并用重組胱抑素C定值；③重組胱抑素C，并溶于馬血清。Pergande等用一種尿蛋白標準品，發現血清胱抑素C濃度存在性別差異，其它研究者利用其它標準品時未發現性別差異。因此，應制定有關標準品制備的統一標準，以便進行方法比較及參考范圍的建立。
4 小結
在腎臟疾病治療中已涌現出許多新方法，如抗炎藥物、腎移植及透析等。在應用這些方法的過程中，腎移植后排斥反應的監測及腎毒性藥物腎毒性監測等。均需一種快速、簡單且能準確地反映GFR變化的指標[15]。無論從理論上還是實踐中，血清胱抑素C的測定均優于血清肌酐的測定，加上能自動化的檢測的PETIA及PENIA方法的建立，已使胱抑素C的廣泛臨床應用成為可能。在今后的實踐中，應注意測定方法的標準化問題；觀察血清胱抑素C濃度在不同腎臟疾病狀態下的變化規律；應在更大的人群內測定血清胱抑素C濃度，以分析是否存在年齡及性別相關的差異；從而最終確定胱抑素C的敏感性及特異性。
參考文獻（省略）
轉摘！
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